Mikroorganisme
yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu
cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi
ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi
untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).
Berbagai
macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana”
dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat
warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan
basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang
mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang
sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat
warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam
encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini
merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Teknik
pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang
sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe
disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.
Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan
pengecatan kapsul.(waluyo,2010)
Mikroba
sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya.
Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna
memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng
mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)
Melihat dan
mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut
maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi
(Rizki, 2008).
2.1
Macam-macam pewarnaan
2.1.1
Pewarnaan
Tujuan
pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
1.
Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2.
Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat
struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. Melihat
reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan
kimia dapat diketahui.
Langkah-langkah
utama teknik pewarnaan
1. Pembuatan
olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi,
dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti
sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi
zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna
Teknik
pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel
bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk
pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan “acid-fast”(tahan
asam) untuk genus Mycobacterium.
Untuk
melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan
spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk
melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium
diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan
pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan
yang spesifik (Pelezar,2008).
2.1.2
Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis
besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :
1.
Pewarnaan sederhana
Menggunakan
satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat
bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya)
dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel
bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah
bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat
basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna
yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut.
Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri
secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru
metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).
gambar
pewarnaan sederhana
2.
Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam
Pewarnaan
differensial
Pewarnaan
bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan
pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
Pewarnaan
Gram
Pewarnaan
Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri
Klebsiella pneumoniae.
Dengan
metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri
Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap
cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh
bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan
beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus
ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding
selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel
terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai
oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam
pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
- Zat warna utama (violet kristal)
- Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
- Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
- Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak.
Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan
setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua
tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan
gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian
cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan
cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian
(dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian
cat lawan yaitu cat warna safranin
Perbedaan
dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang
dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi
peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat
bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri
bakteri gram negatif yaitu:
- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
- lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
- Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
- Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
- Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
- Peka terhadap streptomisin
- Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri
bakteri gram positif yaitu:
- Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
- Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
- Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
- Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
- Tidak peka terhadap streptomisin
- Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Contoh
bakteri gram posittif
contoh bakteri gram negatif
Sumber: “http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram
Pewarnaan
Tahan Asam
Pewarnaan
ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi
sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus
misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna
dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun
seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).
Teknik
pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab
tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara
pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut
Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)
Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)
Sumber:
www.google.com
3. Pewarnaan
khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora,
pewarnaan kapsul.
Pewarnaan
Spora
Spora
bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan
teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling
banyak digunakan.
Endospora
sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan
pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti
halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat
carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus
lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .
Skema
prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton
Protokol
pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:
Sumber:
Prinsip
kerja:
Spora kuman
mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori
membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali
mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan
dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan
mengambil warna biru dari methylen blue.
Cara Kerja :
• Dibuat
suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.
• Dipanaskan
selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit.
• Dibuat
sediaan dan dikeringkan.
• Dimasukkan
kedalam H2SO4 1% selama 2 detik
• Dimasukkan
kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.
• Sediaan
dicuci dengan air.
• Diwarnai
dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.
• Diperiksa
dibawah mikroskop.
Pewarnaan
flagel
Pewarnaan
flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Pewarnaan
kapsul
Pewarnaan
ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika
pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna
pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.
4. Pewarnaan
khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :
- pewarnaan Neisser (granula volutin),
- pewarnaan yodium (granula glikogen).
5. Pewarnaan
negatif
Tujuan
Mempelajari
penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang
sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai
latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti
spirochaeta
Cara
pewarnaan negatif
- Sediaan
hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop
Pewarnaan
negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan
transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan
yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu
bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat.
Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan
negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam
memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam
sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak
berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.
Kajian
religi
- Al-Furqon: 2
2. Yang
kepunyaan-Nya-lah kerajaan langit dan bumi, dan Dia tidak mempunyai anak, dan
tidak ada sekutu baginya dalam kekuasaan(Nya), dan Dia telah menciptakan segala
sesuatu, dan Dia menetapkan ukuran-ukurannya dengan serapi-rapinya[1053].
[1053]
Maksudnya: segala sesuatu yang dijadikan Tuhan diberi-Nya
perlengkapan-perlengkapan dan persiapan-persiapan, sesuai dengan naluri,
sifat-sifat dan fungsinya masing-masing dalam hidup.
2. An nahl:
12
12. Dan Dia
menundukkan malam dan siang, matahari dan bulan untukmu. dan bintang-bintang
itu ditundukkan (untukmu) dengan perintah-Nya. Sesungguhnya pada yang demikian
itu benar-benar ada tanda-tanda (kekuasaan Allah) bagi kaum yang memahami
(Nya),
- Al-Baqarah : 164
164.
Sesungguhnya dalam penciptaan langit dan bumi, silih bergantinya malam dan
siang, bahtera yang berlayar di laut membawa apa yang berguna bagi manusia, dan
apa yang Allah turunkan dari langit berupa air, lalu dengan air itu Dia
hidupkan bumi sesudah mati (kering)-nya dan Dia sebarkan di bumi itu segala
jenis hewan, dan pengisaran angin dan awan yang dikendalikan antara langit dan
bumi; sungguh (terdapat) tanda-tanda (keesaan dan kebesaran Allah) bagi kaum
yang memikirkan
DAFTAR
PUSTAKA
Dwidjoseputro.
2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta
Pelezar,chan.
2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
Waluyo,lud.
2010. Buku Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Umum. UMM. Malang
Widjoseputro,
D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan
Jimmo.,
2008, http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht,. diakses
pada tanggal 14 April 2009, Makassar.
Fauziah.,
2008, www.fkugm2008.com/wp-content/uploads/HSC/1- 2x/6/Praktikum6.pdf. diakses
pada tangan 04 April 2009, Makassar.
